Complessi metallici per applicazioni diagnostiche e terapeutiche in medicina nucleare. Sviluppo di sistemi metallo-legante per diagnostica (es ^99mTc) e terapeutico (es ⁶⁴Cu). Sviluppo di sistemi molecolari organo-metallici ad azione citotossica per applicazioni in medicina.

Sintesi e valutazione biologica di composti metallici di Tecnezio-99m e Renio-188 per la teragnostica in Medicina Nucleare

I radiofarmaci (RF) sono preparazioni medicinali contenenti isotopi radioattivi, di alcuni elementi, utilizzate in medicina nucleare a scopo diagnostico e/o terapeutico. La somministrazione di RF progettati per la distribuzione 'target' specifica di un radionuclide a siti tumorali costituisce un’interessante opportunità per la diagnosi e la terapia dei tumori/metastasi. Tuttavia, la diffusione dei RF 'target-specifici' è condizionata dalla disponibilità di radionuclidi adatti, di efficienti processi di marcatura e di tecniche che ne consentano la specifica localizzazione tissutale. La chimica inorganica è da sempre protagonista nello sviluppo di RF in quanto molti dei radioisotopi utilizzati sono metalli. Tecnezio e Renio, nei rispettivi isotopi radioattivi tecnezio-99m (^99mTc) e renio-188 (¹⁸⁸Re) rappresentano un’interessante coppia di radionuclidi per uso biomedico.

Attualmente la grande maggioranza (>80%) dei RF utilizzati nella diagnostica SPECT (Single Photon Emission Tomography) hanno come base un complesso di coordinazione che contiene l’isotopo metastabile del tecnezio-99 (^99mTc). Le ragioni del successo di tale radioisotopo si riassumono nelle seguenti proprietà: caratteristiche chimico-fisiche ideali (t1/2 = 6.02 h; E_γ=140 KeV); facilità di approvvigionamento e costi relativamente bassi (prodotto da un generatore facilmente trasportabile che sfrutta il decadimento del radionuclide padre ⁹⁹Mo); versatilità chimica. L’interesse verso il renio, congenere del tecnezio nel gruppo 7, è cresciuto da quando il suo isotopo ¹⁸⁸Re [t1/2 =17 h, E_β^–=2.12 MeV; Eg = 155 KeV (15%)] è stato prodotto con un’adeguata attività specifica, attraverso un generatore, del tutto simile a quello utilizzato per il ^99mTc, che sfrutta il decadimento del radionuclide padre ¹⁸⁸W. Grazie alle sue caratteristiche nucleari il ¹⁸⁸Re rappresenta un ottimo candidato per lo sviluppo di RF utilizzabili nei trattamenti terapeutici. Le notevoli similitudini chimiche tra Tc e Re, che si traducono, per complessi stabili aventi stessa geometria molecolare, in un analogo comportamento all’interno di un sistema biologico (es. stessa farmacocinetica), combinate con le favorevoli proprietà fisiche e l’equivalenza dei sistemi di produzione (generatori ⁹⁹Mo/^99mTc e ¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re), rende questi due radioisotopi una coppia ideale per lo sviluppo di composti analoghi ('matching pair') utilizzabili rispettivamente in diagnostica e nella radioterapia interna per il trattamento dei tumori (radiofarmaci teragnostici). In questo contesto l’attività di ricerca è volta alla progettazione e sintesi di nuovi composti inorganici, utili allo sviluppo di nuove tecnologie di sintesi di radiocomplessi utilizzabili nelle applicazioni radiofarmaceutiche e medico-nucleari quali potenziali agenti teragnostici. In generale, la strategia utilizzata prevede la sintesi di complessi mononucleari asimmetrici, caratterizzati dalla presenza di diversi leganti polidentati, dove uno solo di questi è coniugato ad un vettore molecolare selezionato all’interno di opportune classi di proteine, peptidi o farmacofori. Le figure 1 e 2 ne mostrano alcuni esempi. Le tecnologie sviluppate si basano sull’utilizzo di leganti fosfinici bi- o tridentati del tipo PNP (amminodifosfine; Fig. 1) o PS (fosfinotiolati; Fig. 2) che coordinando il metallo (M = Tc, Re) permettono, rispettivamente la formazione dei frammenti molecolari reattivi [MV(N)PNP]²⁺ e [MIII(PS)2]⁺. La sfera di coordinazione del metallo viene saturata da chelanti bidentati (XY) contenenti atomi π-donatori soft/s-donatori, come le coppie NH₂˄S^-, O^-˄ S^-, S˄S^- o N˄S^-, in grado di formare complessi stabili ed in alta resa. Se al chelante XY viene coniugato un gruppo farmacoforo, un peptide o una proteina si formano costrutti utilizzabili per il targeting molecolare. I vantaggi nell’impiego di queste tecnologie sono:
i) elevata efficienza di marcatura ottenuta attraverso una procedura sintesi facilmente trasferibile ad un kit liofilizzato (cold-kit) adatto alla somministrazione nell’uomo;
ii) elevata stabilità in vivo dei complessi finali;
iii) facile coniugazione con i vettori molecolari selezionati.
La tecnologia che utilizza il frammento molecolare [M^V(N)PNP]²⁺ è stata utilizzata anche per la sintesi di una classe di complessi monocationici del tipo [^99mTc(N)(DTC)(PNP)]⁺ (DTC è un legante ditiocarbammico). Gli studi in vivo ne hanno rivelato le interessanti proprietà biologiche quali un’elevata e persistente localizzazione cardiaca ed elevati rapporti cuore/polmoni e cuore/fegato caratteristiche che li rendono utilizzabili nell’imaging cardiaco. Inoltre, studi volti a chiarire i meccanismi di distribuzione, ritenzione ed eliminazione di questi complessi hanno dimostrato che il loro rapido efflusso dai tessuti non bersaglio è fortemente correlato all'azione di trasportatori P-gp (glicoproteine-p), suggerendo che il frammento molecolare [Tc(N)(PNP)]²⁺ potrebbe essere identificato come substrato di P-gp MDR e delle proteine ad esse associate (MRPn, BCRP), aspetto che lascia intravedere la possibilità di ampliare l'ambito di applicazione all'imaging e monitoraggio di forme neoplastiche, nonché nella determinazione dell'attività, espressione e funzione delle P-gp nel cancro e nelle malattie neurodegenerative come l'AD, PD e l'epilessia.

Complessi di rame(I) come potenziali agenti antitumorali

Dagli anni ’70, basandosi inizialmente sul concetto che il rame, elemento essenziale, poteva essere ritenuto meno tossico rispetto a un metallo non essenziale come il platino, sono stati sintetizzati complessi di coordinazione di rame con diverse classi di leganti di cui è stata studiata l’attività antiproliferativa in test in vitro verso diversi tipi di cellule tumorali. Il cis-diamminodicloro platino(II) (cisplatino) dopo 35 anni dalla sua approvazione come chemioterapico è ancora tra le cinque molecole più utilizzate soprattutto nella cura del cancro ovarico, testicolare, polmonare e della vescica. Il mercato mondiale del cisplatino e di altri due antitumorali a base di platino, carboplatino e ossaliplatino, è valutato in alcuni miliardi di dollari. Sfortunatamente l’uso continuativo di questi farmaci è limitato fortemente da severi effetti collaterali dose-dipendenti (soprattutto nefrotossicità e neurotossicità) e da fenomeni di resistenza intrinseca o acquisita al farmaco da parte delle cellule cancerose.

La ricerca di nuove molecole contenenti un metallo (metal-based drugs) biologicamente attive e in grado di superare gli svantaggi del cisplatino ha portato negli ultimi 30 anni alla sintesi di migliaia di nuovi composti a base metallica, di cui nessuno però finora è entrato nella pratica clinica. Il rame è un elemento endogeno che si trova in tutti gli organismi viventi ed è fondamentale in numerosi processi di ossidoriduzione e per il funzionamento di una serie di metallo enzimi. La sua concentrazione è strettamente regolata da processi di omeostasi poiché livelli alterati di rame sono associati a stati patologici come la sindrome di Menkes e la sindrome di Wilson caratterizzate rispettivamente da una deficienza e da un eccesso di rame nell’organismo. Diversi studi hanno però dimostrato che nelle cellule tumorali c’è un abnorme accumulo di questo metallo dovuto all’alterato metabolismo delle cellule tumorali rispetto alle cellule normali e questa maggiore “avidità” di rame può rappresentare un vero e proprio target per lo sviluppo nuovi agenti chemioterapici a base di questo metallo. Basandosi su questo concetto negli ultimi anni ricercatori dell'ICMATE hanno sintetizzato diverse famiglie di complessi tetraedrici di Cu(I) e variando sistematicamente le proprietà chimico fisiche dei leganti utilizzati hanno cercato di trovare delle relazioni tra attività biologica e carica, lipofilicità e/o dimensione dei composti ottenuti. In particolare sono stati studiati complessi omolettici di Cu(I) contenenti fosfine alchiliche terziarie idrosolubili. Tali composti (del tipo “CuP₄”) sono idrosolubili, stabili alla dismutazione in acqua e hanno dimostrato una notevole attività citotossica verso linee cellulari di tumore umano anche resistenti al cisplatino. Il più attivo della serie si è rivelato essere [Cu(thp)₄][PF₀] (thp = trisidrossimetilfosfina), composto idrofilico con elevata attività antitumorale per il trattamento di tumori solidi anche refrattari. [Cu(thp)₄]PF₆ è stabile e solubile in ambiente acquoso, ha dimostrato in vitro una tossicità verso numerose linee cellulari tumorali umane mediamente 2-40 volte più alta del cis-platino, chemioterapico di riferimento, e al contempo una bassa tossicità dovuta alla sua selettività verso cellule tumorali rispetto a cellule normali. Inoltre, è altamente specifico verso linee cellulari di tumore al colon ed è attivo su linee resistenti al cis-platino e all’oxaliplatino, Tale composto è perciò in grado di superare le criticità dimostrate dai farmaci a base di platino, soprattutto la tossicità e la resistenza intrinseca o acquisita, esplicando al contempo una migliore attività citotossica. L’ipotesi che il suo target sia diverso dal DNA è stata confermata da studi sul meccanismo di azione che hanno evidenziato una inibizione dell’attività del proteasoma 26S associata a uno stress del reticolo endoplasmatico e all’attivazione della paraptosi, un meccanissmo di morte cellulare programmata alternativa all’apoptosi. L’efficacia antitumorale di [Cu(thp)₄]PF₆ è stata confermata da studi in vivo su topi nei confronti di leucemia murinica e di carcinoma polmonare di Lewis. Studi di spettrometria di massa sull’interazione di [Cu(thp)₄][PF₆] con peptidi modello contenenti residui metioninici analoghi a quelli incorporati nel dominio extracellulare di hCtr1, trasportatore transmembrana del rame endogeno, avvalorano l’ipotesi che lo ione Cu+, o specie cariche contenenti 1 o 2 molecole di fosfina del tipo [Cu(thp)_1/2]⁺, derivanti dagli equilibri in soluzione che si instaurano a concentrazioni micro molari, possano venire internalizzate sfruttando i meccanismi di trasporto propri del rame endogeno.